Lab 1. Preparation: Making MRS agar plate

Post lab

  • Purpose

MRS agar의 특징을 안다.

Yogurt의 미생물인 유산균을 키위기 위한 MRS plate를 만든다.
Autoclave(고온증기멸균기)의 원리와 사용법 및 목적을 이해한다.

  • Materials

250ml flask, magnetic bar, stirring hot pot(교반기), Aluminum foil, Autoclave(고압 증기 멸균기), 3 of 90mm petri dishes, Alcohol lamp,6.6g MRS broth, 1.8Agar, 120ml DW(1차 증류수)

  • Methods
  1. 120ml의 MRS agar를 만들기 위하여 250ml flask를 준비한다.           – 만들고자 하는 용량의 2배 이하의 용기를 준비하면 끓어 넘칠 수 있으므로, 2배 이상의 용기를 준비하여 용액을 만든다.
  2. 120ml의 증류스를 플라스크에 넣어 부피를 확인한 후 플라스크에 표시한다.
  3. 5.5% MRS broth 와1.5% Agar의 120ml 용액을 만들기 위해 MRS broth 6.6g과 Agar 1.8g을 잰다.
  4. 준비된 MRS broth와 Agar를 250ml 플라스크에 넣고 미리 표시해 놓은 눈끔 선(2)까지 DW를 붓는다. – 배양하길 원하는 미생물이 아닌 다른 미생물로 오염되지 않도록 1차 증류수를 쓴다.
  5. 플라스크에 magnetic bar를 넣고 stirring hot pot위에 놓고 용액을 살짝 기포가 올라올 정도까지가열하며 섞는다.
  6. Aluminum foil 두 겹을 이용하여 플라스크 입구를 감싼다.
    -조그마한 autoclave tape를 포일 위에 붙이고 반과 테이블 번호를 적는다. (autoclave 후에 autoclave tape의 흰 선이 검게 변한 것을 확인하여 autoclave가 되었는지 판별할 수 있다. )
  7. 플라스크를 autoclave에 넣고 120도에서 15분동안 멸균한다. .
  8. 멸균한 플라스크를 책상으로 가져오기 전에 책상을 70%에탄올로 소독해 준다.
  9. Latex 장갑을 끼고 70% 에탄올로 소독한다.
  10. 식힌 stirring hot pot위에 놓고 천천히 섞어가며 약 50~60도까지 식힌다.  플라스크를 세게 흔들어 섞어 기포가 생길 경우 굳고 나서도 공기 방울이 생길 수 있다.
  11. 3개의 9mm petri dishes 외부 바닥 면의 가장자리에 MRS, 날짜, 반, 책상 숫자를 쓴다. Petri dish안은 이미 멸균되어 있으므로 열지 않도록 한다. 뚜껑을 열 경우 공기중 먼지에 붙어 있는 미생물에 의해 오염 될 수 있기 때문이다.
  12. 알코올 램프를 켠다.
  13. 그리고 그 바로 옆에서 플라스크의 호일을 벗기고, 플라스크의 입구를 불로 소독한다. 그리고 MRS agar를petri dishes를 살짝 열어서 petri dish가 1/2이 찰 만큼(~20ml) 붓는다.
  14.  이미 불로 소독한 플라스크의 입구가 petri dish에 닿지 않도록 주의한다. ->오염방지
  15. petri dishes에 담긴 MRS agar를 식혀 굳힌다. -> 균일한 표면을 위하여 붓고 나면 최대한 조심히 옮기고, 남은 MRS agar를 나중에 더 부을 경우 층이 만들어지기 때문에 더 붓지 않는다.
  16. 남은 용액과 magnetic bar를 함께 휴지에 부어 magnetic bar는 깨끗이 씻는다 -> 용액이 굳으면서 수도관이 막힐 수 있기 때문에 용액을 버릴 때 수도관에 버리지 않도록 주의한다.
  17. Sponge brush로flask에 남은 용액을 씻어 낸다.
  • Result

요거트의 미생물을 자라게 할 autoclave로 멸균한 agar medium이 담긴 3개의 petri dish를 만들었다.

  • Discussion
  1. MRS agar 배지는 배양체가 자라는데 필요한 영양물질과 용액을 굳게 만들기 위한 agar를 혼합하여 만든다.MRS broth: Protease peptane과 dextrose는 nitrogen carbon 그리고 여러가지 labtobacilli가 자라는데 필수적 요소를 제공한다. Ammonium citrate, sodium acetate, 2-phenylethyl alchol and cycloheximide는 gram-negative 유기체와 세균 그리고 특정 gram-positive bacteria가 번식하지 못하도록 한다. 또한 cycloheximide는 특정 yeast를 자라지 못하게 한다. Bromocresolgeen은 산성에서는 노란색이 되기 때문에 pH 지시약으로써 들어가 있다.
    Agar:우뭇가사리 등의 해초에서 분리하는 갈락호오스가 주성분인 응고제이다. 미생물이 영양분으로 소화하지 않고 상온에서 굳는 특성을 가진 까닭에 배지 만드는데 많이 이용한다.
  2. 은박지를 플라스크 입구에 덮는 이유는 수증기가 플라스크 안밖으로 이동 할 수 있게 함으로써 플라스크가 고온에서 고압상태가 되지 않도록 한다.
  3. Autoclave는 고온, 고압의 수증기를 사용한 멸균 방법의 하나이다.- 고온, 고압의 수증기로 이용하는 이유는 세균의 endospore(내성포자)가 100도씨 이상에 높은 온도에서만 파괴되기 때문에 멸균을 위해서는 100도씨 이상의 고온의 필요하고, 그러한 고온을 만들기 위해 고압이 필요하다. 일반적으로 120도씨 15lb/psi 압력에서 15분 동안 진행한다.  – 수증기를 사용하는 이유는 멸균하려는 개체의 수분증발을 최소한으로 하여 수분을 유지시키기 위해서이다.  – Autoclave를 하는 순서는 다음과 같다. 우선열선이 있는 기기 바닦에 열선이 잠길만큼 물을 넣는다. 물을 충분히 넣지 않을 경우 멸균을 하려는 것이 타버리거나 화재가 날 수 도 있다. 호일로 입구를 감싼 플라스크를 멸균망에 넣는다. 뚜껑을 닫고 가열하면 기기 내부에서 수증기가 만들어지고 처음 15lb/psi까지 올라갔을 때, 수증기와 혼합된 공기를 배출한다. 수증기에 공기가 혼합되어 있으면 121도씨까지 올라가지 않는다. 121도씨, 15lb/psi에서 15분간 유지시킨다. 완료 후 바로 기기 뚜껑을 열 경우 높은 온도와 많은 양의 수증기때문에 위험해지거나 화재 경보 장치를 작동시키 수 있으니 충분히 식힌 후 뚜껑을 열도록 한다.
  4. 라텍스 장갑을 끼는 이유는 다음과 같다.
    – 실험 중 실험자가 약품에 노출되지 않도록 보호하기 위해서이다. – 실험하려는 물품이 손으로부터 오염하지 않도록 하기 위해서이다.
  5.  알코올 램프로 멸균하는 방법과 원리 알코올 램프 주변의 공기가 데워지고 가벼워지면서 상승 기류를 만들기 때문에 알코올 램프는 켜두고 그 곀에서 실험을 진행할 경우 공기중의 오염으로부터 실험을 보호 할 수 있다.
    • Reference

http://en.wikipedia.org/wiki/MRS_agar

http://himedialabs.com/TD/M1164.pdf

[네이버 지식백과] 한천 [agar, 寒天] (생명과학대사전, 2008.2.5, 아카데미서적)

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