Lab 2: Exercise and Preparation – Exercise pipetting & Making 10X TAE buffer

Pre-lab

  1. purified water (개념, 특징, 이용)

일반적인 물은 물 분자 만으로 이루어 져 있지 않는다. 물에는 무기물, 유기물, 미생물, 여러가지 입자들 등이 포함되어 있다. 실험을 할 때에는 실험과정과 결과에 영향을 미칠 수 있는 이러한 물질들을 제거하거나 통제하여야 한다. 그래서 실험에서는 일반적인 물보다 purified water(정제된 물)을 쓰게 되는데, 일반적으로 distilled water(DW:증류수)나 deionized water(DI:탈 증류수)를 쓴다. 그리고 그 외에도 여러 정제 방법이 있는데 정제 방법을 몇 번이나 거쳤는가 또는 어떻게 거쳤는가에 따라 1차수, 2차수, 3차수 등으로 부른다.

1차수나 2차수는 증류방법을 이용하거나 Reverse Osmosis(역삼투)를 이용하여 얻는다. 증류방법을 이용할 경우, 물을 증류시키고 냉각시켜 물속에 있는 각종 불순물을 제거 해 준다. R/O system를 이용할 경우 만투막을 이용해 인위적으로 삼투압을 반대 방향으로 가해 준다. 불순물들은 반투막을 통과하지 못하여 정제된 물을 얻을 수 있다. 3차수는Ultra-pure grade water(UP:초순수)라고 불리며, 저항이 이론적인 값에 근접하고, 유기물질, 입자, 미생물 뿐만 아니라 이온 또한 제거된 물을 의미한다. 초순수는 1차, 2차를 거친 물을 이온교환 수지에 통과 시키고, 최종여과(polishing)를 통해 만들어 진다.

실험실에서 쓰는 물의 순수의 등급은 다음과 같다.

1 Primary grade water -이것은 역삼투나 이온교환수지를 한번 통과하여 만들어진 가장 낮은 단계의 정제수이다. 이 단계의 물은 유리로 된 실험 기구인 초자기구 세척이나, 민감하지 않은 실험에 쓰이는 시약 용액을 만들 때 사용된다.

2 Deionized water – Deionized water (탈 증류수는) 이온 교환수지를 사용하여 만들어 지고 표준 시약이나, 시료를 희석할 때, 생화학 분석기기용 전제수로 그리고 제약용 정제수 등으로 사용된다.

3 General laboratory grade water – General laboratory grade water는 이차 증류를 통해 얻거나, multiple purification technologies를 통해 얻을 수 있다. 이 단계의 물은 Deionized water 보다도 이온 불순도가 낮을 뿐만 아니라 유기물과 미생물도 거의 제거된 정제수다. 그리고 이 물은 시약 및 버퍼제조에 사용되고, 물에 있는 미생물이 통제 되었기 때문에 세포배양이나 미생물 연구에서의 배지 제조등 다양하게 사용된다.

4 Ultra-pure grade water – 위의 3차수 설명과 같다.

  1. Sterilization (실험 기구,시약 멸균 방법들)

-Dry heat sterilization (건열멸균)

주로 건조 고온을 잘 견디는 유리, 자기, 금속, 섬유로 된 또는 습기가 잘 통하지 않는 물품과 광유, 지방, 지방유 등의 것들을 멸균하는 방법이다. Dry hear sterilizer(건열멸균기)를 사용하여 수증기가 거의 없는 공기를 이용하여 160~180도에서 1~2시간동안 가열하여 멸균한다. 이 방법을 사용하면 spore(아포)도 없앨 수 있다.

-Moist heat sterilization(autoclave)(습열멸균(고온증기멸균기))

Moist heat sterilization는 고온의 수증기를 이용하여 멸균하는 방법이다. Endospore이나 100도 보다 높은 온도에서 죽는 일부 바이러스까지 멸균하기 위해서는 100도보다 높은 온도가 필요하고, 높은 온도의 수증기를 만들어 내기 위해서는 고압상태가 필요하다. 일반적으로 autoclave를 이용하여 121도에서 15~20분동안 멸균한다. 이 방법을 이용하면 미생물은 모두 멸균되지만 일부 바이러스는 남을 수 있다.

-Filtration(여과멸균)

화학물질, 방사선을 통해 멸균이 힘들거나 불가능할 경우, 특히 열에 불안정하거나 열로 인해 변성을 하는 용액이나, 배지 등 여과멸균기를 사용하여 멸균한다. 세균을 제거 하고 싶을 경우 일반적으로 pore size(여과공)의 크기가 0.22~0.45μm인 필터를 사용한다. 이때 사용되는 필터는 cellulose 또는 polyethersulfone로 autoclave에서 견딜 수 있게 만들어져 있다. 필터는 사용하기 전에 무결성 검사를 하고 사용하여야 한다.

-Burning sterilization(화염멸균)

멸균하려는 물체를 분젠, 알코올램프, 가스버너 등을 이용하여 직접 불에 접촉시켜 표면의 미생물을 죽이는 방법을 화염멸균이라고 한다. 유리기구나 도기, 금속기구의 표면 멸균에 이용된다. Incineration(소각)도 화염멸균의 일종이다.

-UV irradiation-Ultraviolet germicidal irradiation(자외선 살균)

Ultraviolet germicidal irradiation (UVGI)는 미생물을 죽일 만큼 충분히 짧은 파장의 UV 빛을 이용하는 소독 방법이다. UVGI는 미생물에 유해한 단파장(UV-C) lamp를 사용하여 소독시키려는 개체에 노출 시켜 유기체의 핵산을 파괴하고 DNA를 방해해 중요한 세포의 기능들을 수행할 수 없도록 만든다. 또한 UV는 광분해 과정을 통해 chlorine and chloramine species를 제거한다. Air sterilization(공기 살균)과 고글, 기기, 피펫 소독 등 실험실 위생에 사용된다.

Post-lab (2A)

  • Purpose

Lab 2A-1 Exercise pipetting

일정량의 볼륨을 옮기는 역할을 가진 pipette의 사용방법, 특징, 주의점을 안다.

다양한 볼륨을 옮기는 pipetting 을 연습한다.

Lab 2A-2 Making 10X TAE buffer (2인 1조)

pipette을 사용하여 10X TAE buffer를 만든다.

  • Material

Pipette(eppendorf), Pipette tips, Blue solution, 1.7ml tube(5개), 0.6ml tube(5개), Parafilm, Rack(for standing micro tubes), Tris1.936g, Acetic acid 456.8ul, 0.5M EDTA 800ul, 50ml tube, DW, pipette aid

  • Methods

Lab 2A-1

  1. Latex glove를 낀다. ->염색 방지,다음 시험에서 오염방지.
  2. 1.7ml tube와0.6ml tube를 위한rack을 꺼낸다.
  3. 1.7ml tube 5개, 0.6ml tube 5개를 준비하여rack에 꼿는다.

→ Tube가 들어있는 플라스틱 통째 autoclave 된 것이기 때문에 tubes을 꺼낼 때, 직접 손을 플라스틱 통에 넣지 않도록 주의 한다. 적당량을 뚜껑에 부어서 플라스틱 내부면에 접촉 하지 않게 주의 하면서 원하는 개수 만큼 tube를 꺼낸다.

  1. 모든tube들의 뚜껑을 닫고 1.7ml tube 뚜껑에는 7-1 1000ul (반 -테이블 번호,pipette으로 연습할 부피)를 적고, 0.6ml tube 뚜껑에는 7-1 200ul를 적는다.
  2. Blue solution이 담긴 통을 연다. → Dis1 blue solution쓰는 이유
  3. 빈1.7ml tube중 하나를 열고, pipette를 써서 blue solution 1000ul를 옮기고 뚜껑을 닫는다. (pipetting) → Dis2 pipette특징, pipetting
  4. 6번을5번 반복한다.
  5. 7번을 완료한1.7ml tube중 하나(*)를 선택하여 열어놓는다.
  6. 빈0.6ml tube중 하나를 열고, pipette를 써서 blue solution 200ul를 옮기고 뚜껑을 닫는다.
  7. 9번을5번 반복한다.
  8. 0.6ml tube하나(#)를 열고, parafilm을 약2cm 잘라 종이면을 바닥으로 향하게 책상위에 놓는다.
  9. 0.6ml tube에서blue solution 2ul를10번, 2ul를 10번 pipetting을 통해 parafilm에 옮겨 사진을 찍는다. →Result 1
  10. Blue solution을12,10,9,8,7,6번 과정을 거꾸로 반복하여 모든 용액이 처음Blue solution cup에 담기도록 한다.
  11. 모든micro tube들은 solid waste통에 버린다.
  12. 다양한 볼륨에 대해서pipette을 어떻게 사용하면 좋을지 생각해 본다. → result 2 → Dis3
  13. 다음 실험을 위해 책상을 정리한다.

Lab 2A-2

  1. 50ml tube를 세울수 있는rack을 준비한다.
  2. 50ml tube뚜껑에7-1(반번호-테이블 번호)를 적고 옆면에 10X TAE, 2014.3.13(용액 만든 날짜) 7-1를 적는다. Dis각각의 역할, buffer가 뭔지.
  3. Tris 1.936g을 재서50ml tube에 넣는다.
  4. DW 20ml를electric automatic pipette을 이용하여50ml tube 에 넣고 뚜껑을 닫는다.->Dis
  5. Vortex의touch mode로 놓고 약한 강도로50ml tube를 한번 섞어준다.
  6. Acetic acid 456.8ul를pipetting하여 50ml tube에 넣고, 0.5M EDTA(pH 8.0)응 넣어준다.
  7. 50ml tube에 만들어진 용액을 메스실린더에 넣고DW pipetting을 통해40ml를 맞춘다.
  8. 다시50ml tube에 넣고 뚜껑을 잘 닫아 실험실 TA 선생님께 제출한다
  • Result
  • Discuss
  1. pipette

– 사진과 명칭이름,

pipette(eppendorf)

– 작동원리 : 공기치환 방식

수용액이나 일반적 실험을 할 때, 사용하는 방식의 pipette이다. pipette의 피스톤과 용액이 접촉하지 않고 그 사이의 일정략의 공기를 남겨두면서 용액의 부피를 취하는 방식이다. 본체가 용액에 직접 닿지 않기 때문에 반 영구적으로 사용 가능하다. 간단한 작동 방식은 다음과 같다.

pipette으로 취하고 싶은 부피를 조정한 다음 팁을 꼿는다. control button을 first stop까지 누른다, 이때, pipette 내부 피스톤이 밀어내는 공기의 부피는 취하고자 하는 부피와 같다. 그리고 그 팁을 용액에 담그고 control button을 천천히 놓으면 압력에 의해 특정 부피의 용액이 tip으로 빨려 들어온다. 이때 본체와 용액은 닿지 않는다. 그리고 다시 control button을 1번째 정지 지점까지 누르면 용액이 tip을 빠져 나가게 된다. 완벽하게 용액을 내보내기 위해 두번째 정지 저점까지 control button을 누름으로써 공기압을 한 번 더 가해준다.

– pipetting

측정하고자 하는 부피에 적절한 pipette를 고른다. 같은 색은 같은 종류의 tip을 사용한다.

setting ring을 이용하여 측정하고자 하는 부피를 조정한다.

pipette이 들어있는 통의 뚜껑을 한 순으로 열고, pipette에 tip을 꼿는다. -> tip이 든 상자는 autoclave된 것이기 때문에 손이 닿지 않도록 한다. 그리고 tip을 꼿은 다음에 바로 통을 닫아 공기중 오염을 초소화 하도록 한다 잘 꼿아지지 ㅇ낳을 때에는 pipette

  • Reference

Post-lab (2B)

  • Purpose

우유와 요거트의 차이를 관찰한다.

우유와 요거트를 배지에 streaking 하여 single colony를 얻기위한 준비를 한다.

Koch’s postulates에 대해 안다. ->Dis 1

  • Material
  • Method
  • Result
  • Discussion
  1. Koch’s postulate
  1. the microorganism must be found in all organisms suffering from the disease but not in healthy organisms.
  2. The microorganism must be isolated from a diseased organism and grown in pure culture
  3. The cultured microorganism should cause disease when introduced into a healthy organism
  4. (만약 1~3을 통해 병의 원인이 되는 미생물을 찾지 못했을 경우) Repeat 1~4

    In this experiment all organisms suffering from the disease : yogurt
    healthy organisms : milk
    한계: 병의 원인이 되는 균이 기술상 isolate 시키기 어려운 microorganism 일 경우 병의 원인이 되는 지 알 수 없다.

  1. streaking

일반적으로  백금으로 만들어진 inculation loop(접종구)에 미생물을 묻혀 고체 배지위해 선을 그어가며 넓게 퍼트러 single colonu를 얻는 방법이다. (방법은 lab 3 pre report에서 설명한다.) 특정한 양의 미생물 시료가 준비될 필요 없이 loop가 담길 정도만 있으면 된다. 여러번 선을 그으므로써 시료를 희석시켜 single colony를 얻기 떄문에 희석되는 정도가 커서, 먼 거리를 둔 single colony를 얻을 수 있다는 이점이 있다. 그러나 오염될 확률이 높은 실험 방법이기도 하다.

* 사실 한개의 세포에서 분열 되었음이 확실 하더라도 single colony의 세포들은 DNA 분석을 해 본다면 전부 DNA가 같지는 않다. 약 1/10^7의 확률로 돌연변이가 나타나기 떄문이다.

  1. E.coli를 LB 배지에 배양하는 이유

MRS 배지는 유산균을 선택적으로, 더 효율적으로 키울 수 있도록 만들어진 배지이다. 특히 MRS의 pH가 낮아 유산균이 살기 좋은 환결을 가지고 있지만, E.coli에게는 살기 좋지 않은 환경이기 때문에 유산균과 다른 배지에서 E.coli를 키운다.

  1. 우유에는 MRS 배지에서 살 수 있는 미생물은 존재하지 않았음을 확인 할 수 있었다. Yogurt plate에서는 E.coli plate와 달리 2개 이상의 다른 종류의 colony가 관찰 되었다. 일반적으로 yogurt를 만들기 위해, 그리고 건강을 위해 2개이상의 다른 종류의 유산균을 우유에 첨가한다는 사실을 알때, 그럴 듯한 결과로 보인다.

두 종류의 yogurt에서 colony가 생기는 시간이 달랐다. 유산균의 농도가 달랐거나, 같은 유산균이 존재하고, 농도가 비슷하더라도 특정 유산균으로 인해 유산균들의 성장 속도가 느려졌을 것이라 추측할 수도 있다. 또는 방부제의 효과도 추측해 볼 수 있다.

  • Reference

Leave a Reply