Lab 3: Microscopy and Koch’s postulate 

Pre-lab

1.Light microscope(광학현미경)

광학 현미경은 optical microscope라고도 불리며, 가시광선을 이용하여 관찰하고자 하는 물체를 크게 볼 있으며, 가시광선을 이용하기 때문에 색을 볼 수 있다. 맨눈으로 볼 수 있는 정도의1000배까지(약 0.2μm)까지 관찰 가능하다. 검체와 주위환경(매질) 사이에 존재하는 대비차(밀도차)에 의해 검체 관찰하게 된다.

대비란 검체를 배경과 구별할 수 있는 정도를 말하므로, 염색을 통해 대비를 증가시키면 검체의 상이 더욱 뚜렷해진다.

광학현미경은 크게 광원의 위치와 관찰대상에 따라 Upright Microscope(정립현미경)과 Inverted Microscope(도립현미경)으로 나뉜다.

-Upright Microscope(정립현미경)

정립현미경은 표본을 위에서 볼 수 있도록 만들어 졌다. 빛은 표본의 아래 쪽에서 나와 표본을 지나 위쪽으로 가도록 설계되었다. 이 유형의 현미경은 슬라이드로 만들어진 표본을 보기 적합하다. 가시광선을 통과시키는 표본에 대해서 높은 해상도를 가진다.

-Inverted Microscope(도립현미경)

도립현미경은 표본을 아래에서 볼 수 있도록 만들어 졌다. 광원은 표본의 위쪽에 있다. 빛은 표본을 지나 아래쪽으로 나온다. 이 유형의 현미경은 페트리 접시 관찰에 적합하다. 가시광선을 통과시키는 표본에 대해서 낮은 해상도를 가진다.

  1. Animal cell staining with Methylene blue

현미경으로 세포를 볼 때, 시각적으로 더 나은 관찰 결과를 얻기 위하여 cell staining(세포 염색)을 한다. 핵이나, 세포벽 또는 세포 전체 등 관찰하고자 하는 세포의 특정 부분에 따라 염색 용액과 염색 방법이 달라진다.

그리고 세포의 특정 부분뿐 만 아니라 세포의 특징을 시각적으로 관찰 할 수 도 있는데, 예를 들어 죽은 세포만 구분하여 염색하거나 세포의 신진대사 과정을 염색할 수 이다. 대부분의 염색은 세포가 고정 되어 있거나 살아 있지 않은 상태에서 진행 되지만 가끔은 살아있는 세포에서도 진행된다.

Methylene blue는 독성이 낮고 핵산 사슬에 침투하지 않기 때문에 (not intercalate in nucleic acid chains) RNA와 DNA 관찰 하기에 좋다. 특히 동물 세포의 핵을 더 잘 보이게 한다. 효모와 같은 세포가 살아있는지 아닌지 알게 해주는 지표로써 사용 될 수도 있는데, 푸른색이 무색으로 나타나면 살아있는 세포라는 의미이다.

  1. Yogurt forming bacteria

요구르트를 만드는 가장 주요한 방법은 무해한 박테리아를 통한 우유의Lactic-acid fermentation (젖산 발효)이다. 가장 기본적인 박테리아는

Lactobacillus bulgaricus(불가리아 젖산간균 – 우유를 강력히 산응고하여 산도 2%에 이르게 하는 역할을 한다.)과

Streptococcus thermophiles(스트렙코커스 서머필러스)이다.

그리고probiotic(프로바이오틱)한 개체도 추가 될 수 있다. 이 박테리아들은 lactic acid를 우유에 생성하므로써 pH를 낮추며, 우유 응결의 원인이 된다. 우유의 pH가 낮아지면서 다른 유해한 박테리아가 살기 힘든 환경을 형성한다.

Probiotic 요거트를 위하여,

Lactobacillus acidophilus(락토 아시도필스균 – 강한 산성(pH3.5~4)에서도 발육하고 유산발효를 한다. 성장에 도움을 주며, 탄수화물을 분해시키는 효소인 아밀라아제(amylase)를 생산한다.)이나

Lactobacillus casei (락토바실러스 카제이-인간의 장이나 입에서 발견되는 락토바실러스(Lactobacillus)속의 혐기성 미생물로서 우유와 치즈에서 분리되었다. 산이나 열에 강하다.) 추가 되기도 한다.

Probiotic- 인간이나 동물의 건강과 성장을 촉진시키기 위해 살아있는 미생물이나 물질을 경구로 투여하는 것, 먹었을 때 영양분으로서의 가치 이상으로 이로움을 줄 수 있는 살아있는 생물체

  1. E.coil(대장균)

보통 (2~4)×(0.4~0.7)μm크기를 가지고 사람을 포함해서 포유류의 장관을 기생장소로 하고 있는 장내세균으로, 통성혐기성 그람음성의 간균이며 글루코오스를 분해하여 산을 생산한다. 건강인의 장관에 상재하고 있기 때문에 장관 내에 존재하는 한 병원성은 없는 것으로 여겨지며 특히 대장균K12주(E. coli K-12)는 갖가지 아미노산·비타민·단백질 등 2천여 가지나 되는 대사물질을 포도당 먹이 하나로 생산하고 개체수가 20~30분에 2배씩 늘어나기 때문에 분자생물학과 생물공학의 연구재료로서 널리 이용되어 왔다.

  1. Reference

Wordlinklab [internet]. [cited 2014 March 17] . Available from

http://www.seehint.com/word.asp?no=10677

미생물학 2장   임상미생물학(1)강의록 [internet]. [cited 2014 March 17] . Available from

http://blog.naver.com/PostView.nhn?blogId=alfks0713&logNo=30084051548

OLYMPUS, basis of Inverted Microscope [internet]. [cited 2014 March 17] Available from

http://www.olympusamerica.com/files/seg_bio/Basics_of_Inv-Microscope.pdf

강영희 생명과학대사전, 2008. [internet]. 대장균[cited 2014 March 17] Available from

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류은주 ,모발학 사전 2003 광문각[internet]. [cited 2014 March 17] 프로바이오틱 Available from

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간호학대사전, 대한간호학회, 1996. [internet]. 아시스필스균[cited 2014 March 17] Available from

http://terms.naver.com/

두산백과[internet].락토바실러스 카제이[cited 2014 March 17] Available from

http://terms.naver.com/

Post-lab

  • Purpose

Light uplight  Microscope(광학 정립 현미경)의 사용법과 주의사항을 안다.

구강상피세포를 염색하고 현미경을 이용해 관찰함으로써 현미경 사용법을 익힌다.

Koch’s postulate 3 (from lab2B discussion1)을 준비한다.

  • Material
  • Method
  • Result
  • Discussion

1.

주요 부분 이름, eyepieces:X10, nosepieces: X4, X10,X40, X100

  1. PBS (phosphate buffer saline 인산완충식염수)

PBS는 미생물을 희석하는데 쓰인다. PBS는 PH를 약 7.4로 유지하도록 도와주고 삼투압 여과 이온 농도가 우리몸의 상태와 근접하기 때문에 미생물을 희석시켰을 때, 미생물에게 손상을 적게 유발하기 때문에 생물 연구에서 많이 쓰이는 완충 용액이다.

  1. microsopic

사용방법: 전원을 키고 관찰하고자 하는 sample를 stage위에 놓는다. 낮은 배율에서 고배율로 가면서, 그리고 x,y control을 이용해 관찰을 원하는 개체를 찾는다. 더 나은 시각적 결과를 얻기 위해 빛의 밝기를 illumination Indensity control로 정정한다. stage를 위에서 아래로 내려오는 방향으로 course adjstment knob와 fine adjustment knob를 이용하여 초점을 맞춘다. 원하는 관찰 결과가 나왔을때, comera switch를 눌러 사진을 찍도록 한다. 대물렌즈로 보는 이미지와 사진으로 찍히는 이미지가 약간 다르기 떄문에 초점과 맑기를 조정해 가며 사진을 찍는다.

주의사항: 현미경을 옮길 때는 손잡이에 한손, 현미경 바닦에 한손을 써가며 두 손 모두를 이용하여 조심히 옮긴다. 렌지는 손으로 만지거나 아무거나로 닦지 말고 lense paper로 닦는다. 다 쓰고 난 후 가장 낮은 배율, 광원은 가장 약하게 stage는 가장 위로 조정해 놓고 전원을 꺼서 정리한다.

  1. 다른 사람들 보다 세포 염색이 잘 되지 않았다. 염색약과 세포가 충분히 섞이지 않았을 것이라 의심할 수 있다. pipetting을 통해 cell과 Fast Blast solution을 겄을 때, control button을 빠르게 움직여서 공기 방울이 생겼었다. 그래서 잘 겄이지 않아 염색 결과가 좋지 않을 것 같다. 그래도 구강상피세포의 핵이 염색되었음을 관찰 할 수 있고 관찰된 상피세포의 크기는 가로로 60um이다.
  1. Postulate 2 과정에서 현미경을 이요해 다양한 유산균과 E.coli를 관찰하는 이유

Milk culture과 Yogurt culture를 통해 아픈 개체인 요거트에는 존재하고 아프지 않은 개체 우유에는 존재하지 않는 미생물의 존재를 확인 하였다. 그러나 Yogurt plate에서 관찰된 colony들이 시각적으로 단 한가지 종류의 유산균만 Yogurt에 존재하지 않을 것이라는 것을 보여주었다. Yogurt plate에서 는 서로 다른 종류의 개체에서 분열 되었을 것 같은 3가지 종류의 colony를 확인 했다. 현미경으로 다른 종류로 보이는 single colony를 관찰하여 여러종류의 유산균이 Yogurt에 들어가 있음을 확인하고 postulate 3과정에서 앞서 각 유산균을 분류하고 비교하기 위해서 이 과정이 필요하다.

6.의 E.coli는 많은 수의 개체가 관찰 되었지만 ‏와의 Yogurt의 유산균은 적은 수의 개체만이 관찰 되었다. E.coli는 Yogurt유산균보다 관찰하는데 걸린 시간이 적게 걸렸음을 고려하고, 짧은 시간내에 유산균 관찰 성공한 다른 실험 결과를 보면 많은 수의 개체가 관찰 되었음을 생각 할 때, PBS의 유산균은 시간이 지날 수록 죽에 되는 것이 아닐까 생각 할 수 있다. PBS는 생체 pH인 7.4와 생체 농도를 맞춘 요액이기 떄문에 유산균이 살기에 적합한 환경이 아닐 것임을 추측할 수 있다

tube 1: negative control

tube 2: positive control

tube 3: 병을 일으키는 종류가 bacteria 인지 아닌지 확인을 할 수 있는 과정

tube 4 &5: 건강한 개체(milk)가 병(유산균 발효)가 되는지 확인

tube 6: 모든 bacteria가 yogurtness를 일으키는 건 아니라는 것을 확인하기 위함이다.

  1. 유산균은 공기가 없는 상태에서 더 잘자라는 혐기성 세균이기 때문에 효율적으로 유산균을 키우기 위해서는 뚜껑을 잘 닫아 공기 차ㅈ단을 하는 것이 좋다.
  • Reference

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