Lab 4: Koch’s postulate 4

Pre-lab

  1. Plate streaking and spreading

-목적

일반적인 자연환경에서의 미생물들은 여러 종류의 많은 수 의 개체가 같이 산다. 개개의 미생물들을 연구하기 위해서는 단일 개체나, 단일 종 만을 분류해 pure culture(순수 배양)하여 연구하여야 한다. 박테리아가 고체 표면에서 움직이지 못한 채로 성장하면 박테리아는 그 자리에서 개체 수가 기하급수적으로 증가한다. 이때 눈으로 볼 수 있을 정도까지 많아지면 그것을 우리는colony가 보인다고 한다. 만약 이 colony가 단일 개체에서부터 분열되었다고 생각할 수 있다면, 이 colony를 a single colony라고 한다. Nutrient solid Medium(영양 고체 배지)위에서 미생물의 농도를 낮추는   Streak Plate Method(획선평판법)과 Pure Plate Method(도말평판법)을 통해 배지 위에 박테리아가 듬성듬성 존재하게 만든다. 이렇게 한 개체가 자리를 잡고 자라게 되면 single colony를 만들어 진다.

Streak Plate Method(획선평판법)

일반적으로 백금으로 만들어진 inoculation loop(접종구)에 미생물을 묻혀 고체 배지 위에 선을 그어가며 넓게 퍼트려 single colony를 얻는 방법이다.

-방법-

Inoculation loop가 빨갛게 될 때까지 화염멸균하고, 20초정도 식힌다. Inoculation loop를 미생물이 포함된 용액에 담갔다가 빼서 미생물이 loop에 묻힌다. 고체 배지에 loop를 눕혀서 다음 그림의 1번의 선과 같이 지그재그 모양으로 선을 그린다. 고체 배지가 찢어지지 않도록 힘을 주지 말고 약하게 선을 긋는다.

*Inoculation loop를 다시 화염멸균을 하고 또 충분히 식힌다.(고체배지 구석과 접촉 식혀 식히기도 한다.) 위 그림의 1번 선(이전 선)을 그은 것과 비스듬한 선이 그어지도록 선을 여러 긋는다.** Plate를 돌려가며 하면 편하게 할 수 있다. 1번 선과 2번 선이 겹쳐진 부분의 미생물만이 2번 선에 넓게 퍼트린 것이므로 2번 째 그은 선 위의 미생물의 농도는 1번 선위의 농도보다 훨씬 작을 것으로 예상할 수 있다. *부터 **까지의 과정을 반복한다.위의 그림과 같이 총 4번 시행 할 경우 Quadrant streak 했다고 하며, 실험 종류와 미생물 용액의 농도 등에 따라 streak 횟수나 방법은 달라 질 수 있다.

Spread Plate Method(도말평판법)

고체 배지에 적은 양(0.1ml이하)의 미생물이 포함된 시료를 넣고 시료를 골고루 펴서 single colony를 얻는다. 이 방법은 낮은 농도와 적은 양의 시료를 쓰기 때문에 골고루 퍼졌다는 추측아래, 시료에 들어 있는 세균 수를 측정하는 방법으로 쓰인다.

-방법-

낮은 농도의 미생물이 포함된 시료를 준비한다. 멸균된 pipette으로 미생물이 포함된 시료를 고체배지 위에 옮긴다. ㄱ자 또는 시옷 모양으로 구부러진 유리막대(spreader)를 준비한다. 소독용 알코올에 담가두어 멸균시키다. 알코올에서 유리막대를 빼서 알코올 불로 화염멸균을 한번 한다. 고체 배지 위에 시료를 골고루 퍼트린다.

*원하는 미생물을 얻기 위해서는 여러 오염으로부터 실험하려는 개체를 보호하는 것이 중요하다.그래서 streaking과 spreading은 알코올 램프 주위에서 하고, 손과 책상은 충분히 알코올로 멸균해야 한다. 그리고 streaking 과 spreading 시 너무 많이 plate 뚜껑을 열지 말아야 한다.

streaking 과spreading 끝나고 뒤집어서 보관한다. 왜냐하면 뒤집지 않고 보관하면 수분이 아래에 차게 되는데, 뒤집어 보관하면 수분이 배지 표면에 차게 된다. 그래서 미생물이 자라는 데 더 좋은 환경을 제공해 줄 수 있다 그리고 petri dish는 뒤집었을 때 공기의 유입이 더 잘 되도록 만들어 져 있기 때문에 적절한 공기 유입을 위해서도 뒤집어 놓는 것이 더 좋다.

  1. Ampicillin mechanism of action

1928년 처음 알렉산더 플레밍에 의해 최초의 항생제인 페니실린이 발견되었다. 그 벤질 페니실린 분자에 아미노기가 첨가 되어 암피실린이 만들어 졌다. 암피실린은 박테리아의 세포벽을 형성하게 하는 골격에 손상을 줘서 세포벽에 구멍이 나타나게 된다. 세포벽 형성은 박테리아의 생존에 중요한 요소이기 때문에 세포벽이 손상된 세포는 죽게 되고, 암피실린은 살균 효과를 나타내는 것이다.

 

Reference

[HCC] Hillsborough Community College [internet] [cited 2014 March 18]. Available from

http://www.hccfl.edu/media/568160/6-exercise%20iii.pdf

미생물 Plate method [internet].[cited 2011 sep 23].Availabe from

http://blog.daum.net/standbuyme/18343653

Streak Plate Method(Theory) [internet]. [cited 2014 March 22].Availabe from

http://amrita.vlab.co.in/?sub=3&brch=73&sim=213&cnt=1

Penbritin(ampicillin) [internet] [2011 May 3].Availabe from http://www.netdoctor.co.uk

Post-lab

  • Purpose

Koch’s postulate 4 과정을 실시한다.

Koch’s postulate 1~3결과를 확인하고 해석한다.

Spreading Method를 익히고 주의법을 숙지한다.

  • Materials
  • Method
  • Result
  • Discussion

Q1: Do all bacteria cause milk to turn into yogurt? What evidence do you have to support your answer?

Milk culture tube의 2번과 6번과 비교해 보면, Yogurt의 특정 bacteria가 milk를 yogurt로 바꾼 것을 확인 할 수 있는 반면 E.coli bacteria를 milk에 넣고 37도씨에서 충분한 시간을 보내도록 했지만, milk가 yogurt로 바뀌지 않았다. 이러한 관찰 결과로 E.coli를 포함한 모든 bacteria들이 milk를 yogurt로 만드는 것을 아님을 알 수 있다.

Q2: why is it important to inculate milk with bacteria from a single colony rather than from multiple bacteria colonies?

병을 일으키는 원인이 되는 특정 병원균을 찾아내고자 하는 것이 koch’s postulate의 목적이다. single colony는 한개의 개체에서 분열하여 생성된 세포의 군집이기 때문에 아주 높은 확률을 가지고 sngle colony를 이룬 세포들은 동일하다고 말 할 수 있다. 만약 multi colony에서 bacteria를 우유에 접종할 경우 어떤 bacteria가 그 병을 일으키는 지 확인하는 것이 불가능하다. 그래서 sngle colony를 접종하여 그 결과를 통해 그 균이 병원 균인지 아닌지를 결론내릴 수 있다.

  1. 유리로된 spreader 일 경우와 금속으로 된 spreader인 경우 소독 순서에 의해 실험 방법이 조금 달라진다. 유리로 된 spreader은 금속으로 된 spreader보다 비교적 빨리 식기 때문이다. 유리로 된 spreader일 경우 smearing하기 바로 직전에 화염 멸균을 하면 되고, 금속 spreader일 경우 미리 멸균을 시행한 후, plate에 시료를 놓는 등 여러 smearing 할 준비를 하면서 긴 시간 들여 식히는 것이 좋다.

또한 알코올이 100%가 아닐 경우, 낮은 농도의 알코올을 쓸 경우 불이 잘 붙지 않아 더 긴 시간을 화염멸균해야한다. 그래서 그만큼 더 식히는 시간이 필요하다.

  1. 화재사고를 조심해야 한다. spreading은 spreader를 1.알코올에 담그고 2.알코올 램프에 넣어 가져다 대 불을 붙이고 끈다. 3.식혀 smearing한다. 그리고 다른 plate를 smearing할 경우 1->2->3을 반복한다. 2->1순서가 되지 않도록 주의를 기울이고 알코올이 spreader에서 뚝뚝 떨어지는 동안 알코올 램프에 가져가면 알코올 방울들을 따라 물이 옮겨 붙을 수 있다.
  1. spreading시에는 낮은 농도의 용액을 쓴다. 그래서 199ul PBS를 통해 1/100로 농도를 조정한다.
  1. 우유가 응고된 이유

우유의 유당을 분해하는 유산균의 발효작용을 통해 유산이 생성되는데 유산은 낮은 pH를 야기하고 그 결과 단백질의 변형이 일어나 우유가 응고된다.

  1. milk culture 4&5가 yogurt가 안된이유

lab 3에서 유산균 관찰을 확실히 하고 유산균을 접종하려 했다. 그러나 유산균 관찰이 1시간 넘게 걸렸다. lab3의 결과 사진에서도 볼 수 있듯이 일찍 관찰한 E.coli의 개체 수 보다 훨씬 적은 수의 유산균만이 관찰 되었다. 그리고 그 관찰결과를 정리하면서 시간을 더 보낸뒤 우유에 접종했다. PBS는 생체와 비슷한 환경(약 pH7.4, 몸과 비슷한 concentration)을 미생물에게 제공해 준다고 생각할 때, 유산균이 살기 좋은 환경은 아니다. 긴 관찰 시간동안 PBS의 유산균은 모두 죽거나 많은 수의 개체가 이미 죽었음을 추측할 수 있다. 그래서 milk culture 4&5의 결과로써 유산균의 흔적을 찾을 수 없었던 것이라고 생각한다.

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