Lab 5: Gram staining (Finishing Koch’s postulation experiment)

Pre-lab

The Gram stain
 1800년대 후반 Hans Christian Gram은 bacteria를 발견하고 구별하기 쉽도록 도와주는 Gram stain 방법을 고안해 내었다. 또한 이 염색법으로써 어떤 박테리아 인지 확인 해 주고, 항생 물질에 대한 반응성 까지 알아 낼 수 있다.
1. Gram positive bacteria
 Gram-positive bacteria는 일반적으로 리포 다당류의 외포가 없는 두꺼운 peptidoglycan 세포벽을 가지고 있다. 이와 같은 박테리아들은 일반적으로 peptidoclycan 합성을 방해하는 항생제인 페니실린 종류의 상생제에 저항성이 있다 대표적인 예로는 S.pneumoniae가 있다.
2. Gram negative bacteria
 Gram-negative bacteria는 리포 다당류의 외포로 둘러 싸인 얇은 peptidoglycan 세포벽을 가지고 있다. 다양한 박테리아 문은 Gram-negative bacteria에 포함 된다. (문은 생물을 분류하는 하나의 범주 단계이다. 다음가 같은 순서로 생물체들은 분류된다. 종 -> 속 ->과 ->목->강->문->계) 가장 대표적인 예는 인간의 소장에 서식하는 E.coli이다. 리포다당류로 만들어진 외포는 페니실린과 같은 상생제에 저항성을 가지게 해 준다. 그러나 외피가 항상 박테리아 생존에 도움이 되는 것은 아닌데, 예를 들어 세포가 서로 통신 할 수 있도록 하는 역할을 가진 단백질의 분비를 방해한다. 또한 계면활성제에 대해서도 저항성이 강하다. 자라는데 특별할 물질을 요구하지 않아 단순하고 산단한 배양액에서도 잘 자란다.
3. Principle of gram staining
Gram stain을 하기 위해서 bacteria를 glas slide에 펴 바르고, 세포 고정제를 추가하기 위해 빠르게 가열한다. iodine solution을 bacteria에 뿌리고, 그 다음 보라색 염색약인 crystal violet을 슬라이드에 충분히 적신다. iodine은 보라색 염색약과 녹지 않는 결합체(insoluble complex)를 형성하게 되고, 알코올로 염색 약을 행궈준다. 알코올은 얇은 peptidoglycan 세포벽의 purple dye complex를 제거해 줄 수 있다. 그러나 두꺼운 peptidoglycan 세포벽의 purple dye complex는 제거 할 수 없다.
 “세포벽에는 teichic acid가 존재하여 탈생제로부터 보호 작용을 하여 crytal violet이 남아 있게 된다.” 마지막으로 분홍색 염색약인 safranin을 가한다. 모든 과정이 끝난 후 현미경으로 관찰 해 보면 어떤 박테리아들은 보라색으로 관찰 된다. 이따, 이 특정한 박테리아 들을 Gram positive bacteria라고 한다. 어떤 박테리아의 경우 알코올을 가해주는 과정에서 보라색 염색이 탈색되고 마지막의 분홍생 염색약으로 인해 염생 되었음을 볼 수 있다. 이런 경우 Gram-negative bacteria라고 부른다.
Reference
그람 염색법 http://joonyoungsun.tistory.com/
staining-Method Brooker, Windmaier, Gram Stiling .2011 Biology Mc Graw hill p552

Post-lab

  • Purpose
Gram staining의 특징과 원리를 안다.
Gram staining의 방법을 익힌다.
배양한 유산균을 분석한다.
  • Material
  • Method
  • Result
  • Discussion
1. 샘플을 slide glass에 smearing 하는 방법
 – cover glass를 약 45도 기울여 silde glass에 접촉한다음 왔다갔다 하면서 smearing 한다.
 – striking method에 쓰이는 loop를 이용하여, 적은양의 시료만 loop에 묻여 smearing한다.
 – pipette으로 시료를 slide glass에 적당량을 옮기고 몇번의 pipetting을 통해 slide glass에 묻혀준다. 그리고 slide glass위의 최대한의 용액의 pipette으로 덜어낸다.
2. heat -fixing 하기 전 제대로 공기중에서 수분을 건조시키지 않으면 heat-fixing 중 수분이 끓게 되고 세포안에서 생긱 기포(증기)가 세포를 터트린다. 세포가 손상되는 것을 막기 위해 충분히 건조시켜야 한ㄷ.
3. Heat fixing은 계란을 구우 때, 계란이 팬에 붙는 것처럼 세포를 살짝 구워 slide glass에 붙도록 하는 과정이다, 여러가지 staining 용액을 쓰고 DW로 행구고, Decolorizer로 행구는 과정에서 세포가 slide에 남아 있게 하기 위해서 꼭 필요한 과정이다. 단 너무 높은 온도를 사용하여 너무 오랬돈안 열을 가할 경우 세포가 파괴될 수 있고 손을 데일 수도 있으니 조심한다. 너무 낮은 온도를 사용하면 세포가 slide glass에 제대로 붙지 않을 수도 있다. Heat fixing을 하는 또다른 이유는 위험균을 관찰 할 때, 관찰 자를 보호하기 위함이다.
4. Bacteria를 구별하는 가장 쉬운 방법 2가지
 1) 세포모양을 직접 현미경으로 보고 그 모양새에 따라 분류한다.
 2) Gram staining을 통해 Gram pisitive, Gram negative를 분류한다.
세포벽의 특징에 의해 Gram staining의 착색여부가 결정되는데 그 결과가 페니실린 종류의 항생제의 반응성과도 연관되어 있어 분류방법으로써 가치가 있다.
5. lab 4에서 요거트를 MRS 배지에 striking 하여 얻은 두가지의 다른 single colony를 #4,#5 milk culture에 접종했지만 이후 변화가 거의 없었다. 우유와 같아 보였다. 그 이유를 여러가지로 추측해 볼 수 있다.
 1) 요거트의 single colony의 박테리아가 우유에 제대로 접종되지 않았을 수 있다.
 2) 요거트의 single colony의 박테리아가 제대로 접종 되었지만 둘다 우유를 yogurt로 변형시키지 않는 박테리아라고 추측 할 수 있다. #6의 E.coli를 넣은 milk culture도 아무것도 넣지 않는 #1 milk culture과 비슷하기 때문이다.
 3) #4,#5 에 요거트 유산균이 제대로 접종 되었지만 그 양이 극소여서 제대로 된 결과가 나타나지 않았을 수도 있다. 의 plate를 48시간 이상 배양 해서 colony를 얻었다는 점과, 100 배 희석된

와 비교했을 때도 colony 개수의 비율이 낮은 것으로 보아 #4, #5 bacteria는 제대로 접종 되었지만 농도가 매우 낮아 있었음을 확인 했다.
또한 #4의 colony와 #5의 colony가 맨눈으로  그 차이가 명확하여 두 개의 다른 종류의 colony가 각각 접종 되었음을 확인 할 수 있다.
6. 더 정확하고 흥미로운 결과를 얻기위해서 1000X 배율에서 관찰 했지만 그 결과가 제대로 나오지 않았다. 초점과 빛 조절에 실패한 듯 보인다. 400X보다 명확하게 보이지 않을 뿐 아니라 생도 구별하기 힘들다.
7
Y : streptococcus themophilus or Leuconostoc mesenteroides
Y4 : Lactobacillus bulgaricus
Y5 : 모양은 Pediococcus 속과 닮았으나 낙농에 이용되지 않는다고 한다. 가장 비슷해 보이는 것은 Lactobacillus bulgaricus지만 qnsaud Y4와 다른 모양이며, Y4보다 짧아서 Lactobacillus casei라고 추측한다.
  • Reference

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