Lab 6: Protein preparation (SDS -PAGE gel preparing & protein Quantification)

Pre-lab

  1. Methods for protein quantification

단백질과 효소의 묘사와 정의 정제, 단백질 발현의 생리적 연구 그리고 체액 안의 단백질 수준에 따른 질병 진단 등의 과정에서, 특정 샘플 안에 단백질 농도는 중요한 정보이다. 단백질 농도를 밝혀내기 위해 여러 protein quantification method가 존재한다. 그 중에 단백질과의 반응을 통해 발색 하는 화합물이 특정 파장의 빛에 반응한다는 특징과 그 특정 파장 영역의 빛을 이용해 UV-Visible spectrophotometer로 흡광도를 측정하고, standard 물질(BSA, BGG)과 비교하여 시료에 단백질농도를 측정하는 spectroscopic analytical procedure이 있다. 이 중에서 가장 많이 쓰이는 것은 Bradford protein assay와 BCA assay를 이용하는 방법이다.

– Bradford protein assay

산성 조건에서 Coomassie brilliant blue G-250라는 색소는 단백질과 비공유 결합을 형성하면 absorption maximum 값이 465nm에서 595nm로 변하게 된다. 이 염색약은 단백질의 아미노산 그룹, 카르복실기 그룹과 Electrostatic interactions을 하고 반데르 발스 힘으로 인해 강한 비공유 결합을 형성한다. UV를 이용한 단백질 농도 측정 방법은 그 단백질 농도에 따라 선형적으로 변하지 않기 때문에 기준이 될수 있는 assay를 같이 측정 하는 것이 좋다.  반응이 빠르고 적은 농도 차이도 감지 한다는 장점이 있다. 그리고 염색약 처리를 완료한 시료는 약 1시간 동안 안정적이어서, 그렇지 않은 방법보다 결과를 신뢰할 수 있다. 그러나 이 방법을 시행 할 수 있는 단백질이 제한적이고 detergent나 염기에 의해 결과가 달라질 수 있다.

1) standard BSA sample과 정량을 해야 하는 sample을 준비합니다.

2) Bradford시약을10:1비율로 가합니다. (주로 sample0.1ml에 시약1ml 사용합니다.)

3) 37°C에 30분간 방치시킵니다. (65°C에서 15분간 방치도 가능합니다.)

4) Vortexting후에595nm에서 30분 이내에 측정합니다. (발색의 원리가 시간에 따른 것이므로 신속하게 하는 것이 중요합니다.)

– BCA assay

알칼리 용액 안에서 단백질이 구리이온(Cu2+, Cu1+)을 환원 시킬 수 있는 성질은 이용한 biuret method를 이용한다. 이 환원된 구리 이온들은 BCA와 결합하여 보라 빛이 나는 화합물이 되고 이 화합물은 562nm에서 빛의 흡수율이 구리 이온이 담긴 용액과, BCA용액이 담긴 용액보다 높기 때문에 spectrophotometer를 사용해서 측정하면 흡광도 차이를 측정할 수 있다. 이 방법은 Lowry method에서 발전된 방법으로 Lowry method에서 쓰는 Folin-Ciocalteu reagent (Folin)대신 BCA를 사용 점이 다르다. 일반적으로 버퍼물질에 민감한 반응을 일으키지 않으며, Bradford protein assay 방법과 다르게 계면 활성제와 같이 사용할 수 있다. 그리고 측정하려 완성된 시료가 빨리 변형 되지 않아 안정적이고 서로 다른 단백질이라도 농도에만 실험결과의 차이를 나타내 준다. 안정된 시료로 만드는 만큼 시간이 오래 걸리고, 단백질이 변질 될 수 있다.

1) Reagent A와 B를 50:1로 섞어줍니다.

2) 0~100mg/ml의standard BSA sample과 정량을 해야 하는 sample을 준비합니다.

3) 섞은 시약을 20:1비율로 가합니다. (주로 sample0.1ml에 시약2ml을 사용합니다.)

4) 37°C에 30분간 방치시킵니다.

5) Vortexting후에562nm에서 30분 이내에 측정합니다. (발색의 원리가 시간에 따른 것이므로 신속하게 하는 것이 중요합니다.)

All method from

http://www.koramlabtech.co.kr/web/bbs/board.php?bo_table=21&wr_id=37

  1. SDS-Phase

개념&원리

Sodium Dodecyl Sulfate-polyacrylamide Gel Electrophoresis

단백질의 아미노산 쪽 결합 끊어서 단일사슬의 polypeptide상태로 만든다. 이 사슬의 길이가 길 수록 그물모양으로 만들어진 gel을 통과하기 힘들게 되고, 이동속도가 느려지게 된다. SDS라는 detergent를 이용하여 모든 단백질이 동일한 음전하를 가지도록 해주어 polyacrylamide gel에서 질량의 차이가 이동속도의 차이로 드러나게 한다. Acrylamide를 cross-linker로 중합한polyacrylamide gel의 구멍의 크기는 Acrylamide의 비율로 조정할 수 있다.

gel의 구성 성분과 역할

-Tris-HCl

Tris는 유효 pH 범위7.2~9.4의 완충액을 공급한다.

stacking gel은 낮은 pH조건을 유지하게 할 때, glycine이 거의 중성을 띠게 되므로 국부적인 전류 감소현상이 유발된다. 따라서 이동도가 빠른 Cl-와 이동도가 느린glycine이온 사이에서 높은 전위차가 발생하게 되고, 이런 전위차로 인해 glycine이 Cl-를 빠르게 뒤쫓게 된다.  Cl-와 glycine 이온의 간격은 수 mm로서 많은 용적의 시료에 있던 단백질들도 running gel에 들어가기 전에 이 사이에 축적되어 해상도를 높이는 효과를 보게 된다.

-glycine

glycine은 zwitterion으로 동시에 음과 양전하를 띌 수 있다. 따라서 gel 내의pH조건에 따라 glycine의 net charge가 변하고 이로 인해 전기영동 속도를 조절 할 수 있다.

-TEMED

Acrylamide를cross-linker로 중합과정에 참여한다. 젤 응고에 도움을 준다.

-APS

gel에 전해질 이온을 공급한다.

Reference

생화학 및 생명공학 실험 #8 Protein Expression, SDS-PAGE|작성자 익룡이야 available from http://blog.naver.com/kirokkk123?Redirect=Log&logNo=90191999213

트리스 [tris] (생명과학대사전, 2008.2.5, 아카데미서적) available from

http://terms.naver.com/entry.nhn?docId=432301&cid=562&categoryId=562

Post-lab

  • Purpose

SDS-PAGE gel을 만들면서 각 과정의 목적을 이해한다.

물고기의 조직으로부터 단백질을 분리해 낸다.

단백질이 섞인 용액에 얼마 만큼의 단백질이 들어있는지 BCA protein assay로 측정한다.(단백질 정량)

  • Material
  • Method
  • Result
  • Discussion
  1. Resolving gel 위에 ethanol로 덮는 이유는 평평한 표면을 얻기 위해서, 그리고 산소가 polymerizatio of acrylimide를 방해하기 때문에 산소를 차단하면 polymerization 의 속도가 올라간다.
  1. Resolving gel과 stacking gel의 차이

pH: resolving의 경우 pH8.8, stacking gel은 pH6.8의 Tris를 쓴다. SDS-PAGE gel에서 cl, glycine, protein가 이온성을띌 가능성을 가지고 있다. pH6.8일 때는 glycine이 거의 관성을 띄기 때문에 전압을 걸어 줬을 때의 이동속도가 cl>protein>glycine이다. 그래서 protein이 양 쪽 이온의 압력을 받아 밀도 높게 쌓이게 된다. 그러나 pH8.8에서는 이동 속도가 cl>glycine>protein이기 때문에 protein이 천천히 움직이게 되고 퍼지게 된다.

acrylamide의 농도 : resolving gel(15%) : 0.5ml/6ml, stacking gel(5%):0.5ml/8ml

Acrylamide의 농도에 따라 젤의 구조에서 molecular가 통과할 수 있는 구멍의 크기가 달라진다. 농도가 높으면 구멍이 커서 molecule들이 보다 빨이 이동을 할 수 있다.

  1. 이번 실험의 microtube들을 항상 얼음에 꼿는 이유

protein의 degradation을 막고 activity를 유지하기 위해서이다. pure protein solution이 아니기 때문에 room temperature에서 몇 protein은 조직의 생물학적 기능들을 통해 denaturation이나 destabilization이 나타날 수 있다. 최대한 그러한 작용을 배제하기 위해 sample들을 저온에 둔다.

  1. RIPA buffer &PMSF

RIPA는 Tris HCl pH 7.6, Nacl, Np-40, sodium deoxycholate, SDS가 들어있다. No-40은 non-ionic detergent이고 SDS는 ionic detergent이다. detergent는 세포막에 붙어 miselle형성을 통해 세포벽을 파괴한다.

PMSF(phenylmethansulfonyfluoride)는 protease inhibitor로 실험 과정에서 cell 자체는 분해되지만 protein은 분해되지 않도록 한다.

  1. incubate 10 minute : 세포벽이 충분히 파괴될 때까지 시간을 주기 위해서 하는 과정이다.
  1. standard curve를 만드는 이유 -BSA와 반응한 시간에 따라 흡관도가 다르게 측정되기 때문에 같은 시간을 BSA와 반응 시키면 standard solution을 지표로 삼아야만 구하고자 하는 protein의 농도를 알 수 있다.
  1. Table 1의 A.1~A.4를 통해 추세선을 그랬으며 농도와 흡광도와 관계는 약

y=0.093x +0.0632로

나타났다. 이것을 통해 unknown protein의 흡광도를 이용해 그 농도를 구할 수 있다. 그 결과는 table 2의 5~8에 작성되었다.

  1. Table 1으로부터 Table 2를 구했다. 10ug이라고 쓰여진 칸은 5~8까지의 시료에서 단백질 10ug을 쓰고 싶으면 취해야 할 부피를 나타낸다. SDS -PAGE를 할 때, protein의 농도가 지나치게 많으면 안되기 때문에 계산 해 놓는다.
  • Reference

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