Lab 7: SDS-PAGE : Protein seperation 

Pre-lab

  1. Protein loading buffer.

2x sample buffer (2% SDS, 20% glycerol, 20mM Tris-Cl, pH 6.8, 2mM ethylene diamine tetraacetic acid (EDTA), 160mM dithiothreitol (DTT), and 0.1 mg/ml bromphenol blue dye) 종종 DTT은 2-mercaptoethanol 대신 사용된다. “Because the latter has a much stronger unpleasant odor and it doesn’t denature our blood fractions very well.”

2-mercaptoethanol: sample buffer을 사용할 때 한번 끓여 주어야 하는데, water bath가 실질적으로 끓는 점이 되지 않기 때문에 끓기 위해서는 2-mercaptoethanol이 필요하다.

EDTA는 칼슘과 마그네슙 이온을 필요로 하는 proteolyic enzyme의 활동을 방해한다.

Tris는 pH buffer이다.

glycerol은 sample을 sample buffer보다 더 밀도 있게 만들어서 sample을 가라앉도록 도와준다.

SDS, DTT의 첨가와 가열의 목적은 sample의 denaturation이다.

단백질이 녹아 있는 용액에 loading buffer의 섞은 다음SDS-PAGE gel의 comb으로 만든 lane에 일정량을 취해 넣어서 loading 한다.

  1. Running buffer

10X의 running buffer을 만들어 놓고 보통 10배로 희석하여 사용한다. 10X의 running buffer에는 30.0 g of Tris base, 144.0 g of glycine, and 10.0 g of SDS in 1000 ml of H2O가 들어간다. HCl과 glycine이 들어가 있어서 용액에 전류가 잘 흐르도록 도와주는 역할을 하고 sample이 어디까지 내려갔는지 눈으로 파악할 수 있게 도와준다.

  1. actin/myosin

근육을 형성하는 기본적인 구조단백질이다. actin의 분자량은 약41,872이며, myosin은 약 48만이다.

“actin: 근원섬유의 액틴 필라멘트(F액틴)를 구성하는 수축성 단백질이다. 단량체는 G액틴이라 불리는 단일 펩티드사슬이며 분자 안에 칼슘과 ATP를 1몰씩 함유하고 있으며 방울 모양의 분자로 되어있다. 이것이 여러 중합하여 이중나선의 섬유구조를 취함으로써 F액틴을 형성한다.

myosin: 근육 단백질의40%이상을 차지하는 글로불린 모양의 단백질이다. 거의 불용성에 가까운 젤을 형성하기 때문에 근육의 수축과 이완에 중요한 역할을 한다. 굵은 잔섬유는 미오신 분자가 중합되어 만들어졌으며, 두 개의 팽창된 머리부분을 갖고 있다. 성냥개비모양의 구조이다. “

Reference

Actin [internet] [cited 2014.04.14] available from

myosin [internet] [cited 2014.04.14] available from

http://www.kmle.co.kr/ebook_terminology_view.php?Num=2&Md=daa6300da2d33f7225595a66b7fcd710&TitleLetter=%B0%A1%B4%C2%B1%D9%C0%B0%C0%DC%BC%B6%C0%AF%3A+actin

2x Sample Protein Gel Loading Buffer [internet] [cited 2014.04.14] available from

http://www.kmle.co.kr/ebook_terminology_view.php?Num=2&Md=daa6300da2d33f7225595a66b7fcd710&TitleLetter=%B0%A1%B4%C2%B1%D9%C0%B0%C0%DC%BC%B6%C0%AF%3A+actin

8생물기기분석 실험  [internet] [cited 2014.04.14] available from

http://kbp.donga.ac.kr/xanta%EB%85%B8%ED%8A%B8/2012/2012-2/12-2-bioanal(exp)/11-2-bioanal-exp-8.htm

Post-lab

  • Purpose

SDS -PAGE의 방법과 원리를 익힌다.

SDS -PAGE로 4 fish protein의 protein seperation을 통해 진화관계를 추측해 본다.

Gen sequence(cytochrome b)를 이용하여 진화적 비교 관계를 확인 한 다음 SDS-PAGE로 유도된 결과와 비교한다.

  • Material
  • Method
  • Result
  • Discussion
  1. 단백질을 denature 시키기 위해 단백질을 끓는 물에 넣어준다.

내부에 running buffer를 넣는 이유 : SDS-PAGE gel에 전류가 흐르게 하기 위해서이다.

외부에 used running buffer를 넣는 이유 : 두 glass plates 사이가 막혀있지 gel의 끝부분이 외부와 접촉할 수 있는 구조로 되어 있다.  gel의 끝이 running buffer와 맞닿게 하여 well 에 넣는 용액이 gel의 끝까지 흐를 수 있도록 해준다. 내부에 넣는 용액은 sample moving에 직접적인 영향을 주기 때문에 새것을 서야 하지만 외부는 전기가 흐를 수 있을 정도만 되면 되므로 used를 쓴다.

3.

Construct a phylogenetic tree of fish species using SDS-PAGE date : Figure 4

Construct a phylogenetic tree of fish species using cytochrome b gen sequence from NCBI database / UPBMA method : Figure 5

Construct a phylogenetic tree of fish species using cytochrome b gen sequence from NCBI database / Maximum parsimany method : Figure 6

Scomberomorus niphonius : 삼치

Trichiurus leptures : 갈치

Konosirus punctatus : 전어

Gadus macrocephalus : 대구

Figure 4 의 tree 모양과 Figure 5 tree 모양이 동일함을 확인 할 수 있다.

Figure 4 는 대부분 근육으로 이루어진 생선 살을 protein seperation하여 myosin의 light chain이 15-25kDa 이라는 정보를 가지고 얼마나 비슷한 light chain을 가지고 있는지를 분석하여 만들었다. 진화적으로 가까울수록 짧은 종류의 light chain이 많이 보일 것이라는 가정이 들어 있다 특히 이 실험에서는 분명하게 분자 질량을 측정 할 수 없어서 Figure 1에서 26kDa을 표시해준 standard mark를 기준으로 그것보다 가벼운 모든 protein을 비교했다.

Figure 5는 cytochrome b gene sequence를 이용하여 sequence 상 동일 하 ㄴ것이 많을 수록 진화적인 관계가 더 가깝다는 가정에서 만들어 졌다.

Figure 4 의 tree 모양과 Figure 5 tree  같은 결과를 내었다는 것은 진화적 관계에 대해 신빙성을 높여주며, gen sequence 비교 결과오 protein 비교결과가 같은 비교방법을 상용한다면 비슷한 결과를 낸다는 사실을 확인했다.

Figure 6 은 하나의 서열이 다른 것으로 변형 될 때, 변화를 최소화 하는 방향으로 진화가 이루어 졌다는 가정을 기반으로 한다.

Figure 5 와 Figure 6에서 진화적 관계를 분석할 때, 분석 방법이나 가정이 다른면 다른 결과를 보여준다는 것을 알려준다.

  • Reference

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