Lab 8A ; Transformation

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Pre-lab

1. principle of Transformation (형질 전환의 원리)
세균 중에는 균체 외부에 존재하는 DNA를 균에 내부로 유입하여 자신의 형질을 변화시키는 것이 있는데, 이 변화를 형질 전환이라고 일컫는다. E.coli 세포를 다가이온 존재하에 낮은 온도(0도씨)에 놓으면 외부의 DNA를 받아들일 수 이쓴ㄴ 상태가 되고 이를 comptent cell이라고 부른다. 온도가 낮아 세포막의 안이 안정적이게 되고, 이때 heat shock를 가하면 세포 안쪽과 바깥쪽의 온도차로인해 DNA가 세포안으로 들어가게 된다.

2. pGLO
pGLO는 biotechnolongy에서 쓰이는 genertially modified organisms을 만들어 내기 위한 조작된 plasmid이다. 우선 plasmid는 균의 세포내에 있는 고리 모양의 DNA로 독자적 증식이 가능하ek. pGLO는 engineer적인 조작을 통해 green fluorescent protein(GFP) gene과 ampicillin resistance gene이 포함되도록 한 plasmid이다. GFP gene이 발현되어 protein이 세포안에서 만들어지면, 그 protein은  UV light를 쐬어 주었을 때 초록색으로 비나는 특성을 가진다. 그 때문에 pGLO plasmid가 transformation 되었는지 UV-light를 이용하여 쉽게 관측할 수 있다. GFP gene은 arabinose를 물질대사하는 gene과 promoter를 공유하기 때문에 GFP gene은 arabinose가 있는 환경에서 발현한다.

Arabinose operon
L-arabinose operon은 ara operon이라고도 불리며 arabinose를 xylulose 5-phpsphate로 이화작용에 필요 한 효소를 encoding 하는 gene sequence이다. negative 와 positive regulation이 둘다 존재한다.

3. principle of DNA precipitation
물은 극성을 띈 분자이다. 그래서 DNA와 RNA 같은 극성 분자들은 전기적으로 물과 반응하여 물에 쉽게 녹는다. Nucleic acids들은 phosphate(PO3-) 그룹의 negatively sugar phosphate back bone과 연결되어 있다. Ethanol precipitation은 이렇게 물에 녹아 있는 nucleic acids를 preparation하는 가장 흔한 방법이다. aqueous solution에 ethanol과 salt를 넣는다. salt는 sugar phosphate backbone을 중성화 하는 역할을 한다. 이때, salt로 가장 흔히 쓰이는 것은 sodium acetate이다.  soudiem acetate는 Na+와 [CH3OO]- 로 나뉘고, sodium ion들은 nucleic acid 그룹의 PO3- 의 negative charge를 중성화 한다. 결국 분자들은 덜 hydrophilic 하게 되고 물에 덜 녹게 된다. 침전법으로 nucleic acid가 덩어리로 뭉쳐 옹액와 seperation 된다. 차가운 70% ethanol에 덩어리로 뭉쳐진 nucleic acid(pellet)을 행구고 centrifugation 하여 ethanol을 없앤다. ethanol로 행구는 이유는 물은 high dielectric constant를 가지고 있기 때문에 Na+와 PO3-의 상호작용 약하게 만든다. 반면에 ethanol은 dielectric constant가 낮기 때문에 Na+와 PO3-ㅏ강하게 상호작용하게 하기 때문에 nucleic acid의 hydrophilic정도를 낮게 만들어 용액으로부터 분리 가능하게 한다.

Reference
GFP에 대해서 퍼온글  http://blog.naver.com/PostView.nhn?blogId=kyonak&logNo=20171745940
pGLO http://en.wikipedia.org
L-arabinose_operon    http://en.wikipedia.org
Ethanol precipitation    http://bitesizebio.com/

Post-lab

  • Purpose
cell의 DNA를 transformation하는 방법과 원리를 안다.
Transformation을 확인하는 방법과 원리를 익힌다.
DNA transformation에 사용할 pGLO를 안다.
  • Material
  • Method
  • Result
  • Discussion
1. Heat shock
 10분간 ice에 incubate해서 안정된 세포에 갑자기 노은 온도를 주게 되면 cell의 안쪽과 바깥쪽에 다른 압력이 형성되고 그로 인해 pGLO가 세포벽을 통과하여 세포 안으로 들어간다. 그리고 다시 ice에 2분간 방치하는 까닭은 낮은 온도가 DNA thermal motion을 줄여 세포벽을 더 잘 통과할 수 있을 것이란 추측에 기반한다.
2.
A plate :  control plate로 LB만으로 E.coli가 정말 잘 자라는 환경인지, 그리고 아무 조작도 하지 않은 환경에서 transformation하지 않은 E.coli가 어떻게 자라는지 보여줌으로써 B,C,D와 비교해 볼 수 있다.
B plate : Amp를 넣었다. transformation 하지 않은 E.coli가 Amp에 어떻게 반응하는지 보여 준다. A에는 수많은 E.coli colony가 자랐고, 반면에 B에는 어떤 E.coli도 자라지 못한 결과로 보아 일반적인 E.coli는 Amp에 저항성이 없으며, 그 저항성이 자연적으로 생기는 확률도 낮음을 알 수 있다.
Transformation된 E.coli를  Amp가 든 LB(C plate)에 배양했더니 몇개의 single colony를 관찰 할 수 있었고 그 E.coli는 transformation 결과로 amp의 저항성을 가지게 되었음을 B와 C를 비교하여 결론지을 수 있다.
LB와 amp, ara가 든 D plate를 맨눈으로 관찰한 결과는 C와 같은데,

의 관찰에 따르면 오직 D plate만 UV light 아래서 푸른 색 빛을 낸다. trnasformation된 E.coli가 빛을 낸다는 점 그리고 ara가 든 plate에서만 빛을 낸다는 점에서 E.coli는 transformation을 통해 발광 protein gene을 가지게 되었고, 그 gene sequence는 arabinose가 있는 환경에서만 발현됨을 확인할 수 있었다.
  • Reference

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