Lab 9: GFP chromatogrph

Pre-lab

  • protein chromatography
solvent가 특정 material을 지날 때, material과 solvent의 분자에 따라 그 속도가 늦춰지는데, 이러한 현상을 이용한 seperation techique의 한 종류를 chromatogrphy라 한다. 이와 같은 원리가 최근 protein seperation에 많이 이용되고 있으며, stational phase라 일컫는 물질이 tube안에 채워져 있고(column), mobile phase(eluent)가 그 사이를 지나가게 하는 column chromatography 가 가장 흔한 방법으로 이용된다. molecule들이 stationary phase에 얼마나 interaction 하는지에 따라 mobile phase의 속도가 결정되고, 특정 속도의 solvent를 모아 individual protein을 purifying 할 수 있다.
각 protein의 solubility, size, charge, adsorption 차이가 이동속오에 영향을 미친다. 예를 들어 Ion exchange chromatogrphy는 ligands(ex. enzyme inhibitors, coenzymes, antibodies)를 이용하여 특정 단백질이 column에 붙게 되는 성질을 이용한다. Size차이는 size exclusion chromatography로 size와 charge의 종합적인 차이는 Electrophoresis chromatography로 seperation한다.
  • Hydrophobic Interaction Chromatography(HCI)
biomolecule분야에서 HIC는 analytical그리고 preparative seperation하기 좋은 방법으로 알려져 있다. 단백질이나 다른 molecule의 hydrophobic 한 표면을 이용하여 용액에서 분자들이 seperation된다. HIC는 특히 비슷한 isoelectric point가 있거나 비슷한molecular weight를 가진 분리하기 힘든 혼합물을 분자 크기나 ion-exchange chromatogrphy에 영향을 받지 ㅇ낳음으로써 효과적인 seperation을 가능케 한다. HCI에 의한 선택적인 차이는 비슷한 인식 부위로 인해 affinity ligand로 분리하지 못하는 단백질에 사용할 수 있다.
단백질과 같이 hydrophobic한 표면을 가진 분자들은 High salt quaeous 상태에서 HIC수지 에 상대적으로 약한 결합력을 가진다. 그러나 그것들은 낮은 salt concentration에서 HIC 수지와 분리 된다. 거의 salt농도가 0에 가까울 때는 대부분의 component가 HIC수지와 분리된다. 그래서 sample component의 hydrophobicity와 HIC의 hydrophobicity의 matching은 이 seperation에서 가장 중요한 요소이다.
  • buffers
– Equilibration buffer
medium salt buffer로 (2M (NH4)2SO4) chromatography의 column을 “equilibrate” 도는 “prime”하게 한다.
– Binding buffer
위와 같은 양의 부피를 사용하며 4M (NH4)2SO4이다. 추출하고자 하는 단백질의 용액의 농도를 high salt solution으로 맞춰주어 단백질의 hydrophobic부분이 더 잘 exposed 되고 column의 hydrophobic 부분과 더 잘 붙도록 한다.
– Wash buffer
1.3M (NH4)2SO4
column에 약하게 붙어있는 단백질들을 떼어내기 위해 medium salt 용액을 쓴다. 예를 들어 우리가 추출하고 싶은 것이 GFP라면 GFP보다 약한 결합력을 가진 단백질을 제거해 준다.
– Elution buffer
low salt buffer(TE solution; 10mM Tris/EDTA)를 쓴다. 낮은 salt buffer에서 (물론 물보다는 농도가 높다)  column에 붙어있던 단백질이 buffer와 더 큰 affinity를 가지게 된다. 그래서 특정 단백질이 column에서 떨어져 씻겨나가게 된다.

Post-lab

  • Purpose
GFP protein을 chromatography로 분리하기 위해 liquid culture에 transformation된colony를 inonulation하여 준비한다.
  • Material
  • Method
  • Result
  • Discussio
1. 완벽히 닫히지 않는 뚜껑을 가진 tube로, E.coli는 산소가 있을 때 더 잘 자라기 때문에 이 tube는 incubator에서 tube안에 공기가 잘 들어 갈 수 있도록 해 준다.
2. 분리하길 원하는 protein이 GFP protein이고 이것을 32도에서 E.coli 배양을 통해 얻게 되면 세포가 깨져도 단백질이 안정적이게 된다. 그래서 E.coli 최적온도인 37도씨 보다 낮은 32도씨에서 E.coli를 배양한다.
  • Reference

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