Lab 10: Mini prep

Pre-lab

1.Preparation of Plasmids DNA from E.coli by Alkaline Lysis
(Mini prep의 개념, 원리, 방법)
Mini prep은 DNA를 소량(mini) 추출하는 한다는 뜻으로, Mini prep은 plasmid DNA 추출이 그 목적이다. pH를 이용하여 DNA를 분리하기 때문에 Akaline lysis method이다.
세포 안의 plasmid DNA를 separation하기 위해서는 가장 비슷한 chromosomal DNA와 구분이 되어야 한다. 박테리아 안의 chromosomal DNA는 double-helix 형태를 가지고 비교적 크기가 큰 반면, plasmid는 supercoiled 구조를 가지고 크기가 작다.(약 chromosomal DNA의 8%) SDS와 NaOH가 들어간 용액은 두 가지 DNA가 변형을 일으키는데, 그 정도가 chromosomal DNA가 plasmid DNA보다 크다. 그리고 세포벽을 구성하는 고분자화합물 (β-1.4 -글루코시드) 결합을 끊는 lysozyme과 세포벽을 온전하게 유지하는데 필수적인 calcium ion을 제거하는 역할을 하는  EDTA을 이용하여 세포벽을 깬다. 그러나 삼투압을 유지하게 하는 glucose를 이용하여, 세포가 모양을 유지하도록 한다. 세포가 완전하게 깨지지 않았고, 변성이 크게 일어난 chromosomal DNA는  potassium, SDS, 세보벽 깨진 것과 종합적으로 엉켜, centrifuge를 통해 침전되고 plasmid DNA만 따로 추출 할 수 있게 된다.

방법
1) transformation된 Bacteria의 single colony를 따서 Bacterial culture tube에서 배양한다.
2) 배양후 원심분리하여 spernatant를 버리고 pellet을 Cold-STE buffe(0.25 X volume)로 가볍게  washing한다. (bacteria에 남은 배지를 제거한다.)
3) 다시 원심분리하여 supernatant를 버린다.
4)RNase를 첨가한 alkaline lysis solution 1을 cell pellet과 잘 섞이도록 한다.
5) alkaline lysis solution2 를 첨가한 후 살살 섞어준다.(세포벼기 충분히 약해진 상태이고, chromosomal DNA가 유출되지 않도록 해야한다.)
6) alkalinelysis solution 3를 첨가한 후 천천히 inverting한다.
7) 원심분리를 하여 supernatant 만을 취한다.
8) 같은 양의 volume 만큼 PCI를 넣어주어 원심분리 하여 supernatant의 단백질을 가라 앉힌다.
9) 또다시 supernatant 만을 취하고 -20도씨 100% ethanol을 supernatant 2배의 부피를 섞어 DNA를 침전시킨다. (Ethanol precipitation)
10) 원심분리를 한 후 supernatant를 버리고 다시 70% ethanol을 첨가하여 DNA와 함께 남은 salt를 제거하기 위해 상온에서 원심분리를 한다.
11) supernatant를 버리고 ethanol을 말리고 TE(pH 8.0) buffer로 pellet을 완전히 녹인다.

2. Alkaline lysis solution 1, 2, 3(조성, 구성 성분 역할)
-Solution 1 Resuspension buffer
25mM Tris.HCl pH8, 10mM EDTA pH8, 15% sucrose/glucose
EDTA는 cell wall의 Mg2+를 chelating 한다. cell wall을 깨지기 쉬운 상태로 만들고, cell이 깨지지 않게 하기 위해 glucose로 삼투압을 유지시킨다.

-Solution 2 Lysis buffer
0.5M NaOH; 1% SDS
SDS는 detergent로써 세포의 막을 구성하는 인지질을 녹인다. NaOH로 pH를 변화시켜 DNA가 변성되게 한다.

-Solution 3 Neutralizing buffer
3M Potassium Acetate pH5
높아진 pH를 급격히 낮춰 중성으로 만들면 plasmide DNA는 renature되고 변성정도가 컸던 chromosomal DNA는 potassium, SDS와 엉켜 침전된다.

3. Measure of nucleic acid(DNA, RAN) purity
-260/280 Ratio
1) DNA 농도측정의 원리
핵산, 뉴클레오티드 및 뉴클레오시드 등은 자외선(260㎚)을 강하게 흡수하는데, 이것은 퓨린 및 피리미딘 염기의 공명구조 때문이다. 개개의 염기들은 각기 특성적인 자외선 흡수 스펙트럼을 가지며 핵산의 총흡광도는 핵산을 구성하는 염기들의 총흡광도의 합과 같다고 생각할 수 있기 때문에 260㎚에서의 흡광도를 측정하여 DNA 농도를 산출할 수 있다. 한편 단백질이 강하게 흡수하는 280㎚에서의 흡광도를 측정하여 Purity(순도) = A260 / A280 의 비로 계산함으로서 단백질에 의한 오염상태를 추정할 수 있다.
퓨린, 피리미딘 염기는 방향족 구조로 자외선을 흡수하는 성질이 있다. pH 7, 260㎚에서 최고의 흡수성을 가진다.

2) 분광광도계(Spectrophotometer)
분광광도계는 시료의 흡광도를 파장의 함수로서 측정하기 위한 기기이며 일정한 파장에서 시료를 측정하거나 파장이 연속적으로 변화하여 흡수 스펙트럼을 측정할 수 있다. 이러한 측정기기는 스펙트럼 영역에 의하여 자외선 분광광도계 또는 적외선 분광광도계 등으로 분류된다.

[출처] DNA 정량|작성자 유나니
http://blog.naver.com/ynh1205?Redirect=Log&logNo=130152381320

reference
3.Mini-prep
http://blog.naver.com/kangyu718?Redirect=Log&logNo=40194458519
miniprep 과정에서요
http://bric.postech.ac.kr/myboard/read.php?Board=exp_qna&id=208845
miniprep
http://dasan.sejong.ac.kr/~yjlee/3-3.htm
Extraction of Plasmid DNA
http://www.genehunters.co.kr/Training/01_3_3.htm
Alkaline Lysis – Solution 1, 2, 3
http://www.sci-mate.org/wiki/index.php/Alkaline_Lysis_-_Solution_1,_2,_3
Absorption ratios 260/280 and 260/230 forRNA
http://biology.stackexchange.com/questions/618/absorption-ratios-260-280-and-260-230-for-rna
DNA 정량
http://blog.naver.com/ynh1205?Redirect=Log&logNo=130152381320

Post-lab

  • Purpose
chrosomal DNA와 plasmid DNA를 seperation하는 Alaline lysis method를 알고 이해한다.
plsmid DNA를 purfication 하는 방법을 알고 이해한다.
Nano Drop으로 concentration of pGLO를 측정하는 원리와 방법을 이해한다.
  • Material
  • Method
  • Result
  • Discussion
1. Solution 2의 NaOH는 용액을 염기 상태로 만들어 주어 chromosomal DNA가 Plasmid DNA를 denature 시킨다. strong base인 NaOH는 큰 pH 변화를 일으키고 hydrogen ion의 농도를 낮춘다. 반면에 hydroxide ion의 농도는 크게 높여주어 (DNA의 double strands bonding에 관여하는) hydrogen bond를 야기하는 DNA의 base pair의 hydrogen ion을 hydroxide ion이 잡아당겨 hydrogen bond를 방해한다. 그 때문에 double strand가 single strand가 된다.
Acidic condition에서는 depurination이 일어나 DNA 가 파괴된다.
2.debris는 chromosol DNA와 potassium, SDS, 세포벽 등의 기관이 뭉친 것으로 추측할 수 있다.
3. silica membrane dl DNA purfication에 이용되는 이유
silica membrane은 negative charge를 띈 규소이온인데, DNA phosphate의 negative charge와 silica membrane 사이에 양이온이 끼게 되면 negative charge를 띈 DNA를 filter가 잡을 수 있게 된다. 단백질과 RNA도 이러한 원리로 filter에 붙을 수 있기 때문에 미리 RNase나 pH에 의한 변성을 통해 filter와의 결합을 막는다.
4. 260nm에서 흡광도 값이 1일 경우 50ug/ml H20이기 때문에 정확한 값은 아니지만 pure한정도가 높게 측정되면 concentration = 4.676 * 50ug/ml = 233.95ug/ml 로 계산할 수 있다. Result에서도 이야기 했듯이 <Table 1>의 1 값은 용액이 pure하다고 이야기 해 주는 반면 2 값은 pure하지 않다고 이야기 하고 있다. 2의 값은 단백질 이외의, EDTA, EtoH의 잔류 정도가 크다는 것을 의미한다.
  • Reference

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