Lab 11: RE digestion of DNA

Pre-lab

DNA Quantification

핵산과 뉴클레오티드, 그리고 뉴클레오시드는 퓨린과 피리미딘의 염기 공명 구조 때문에 260nm의 빛을 강하게 흡수한다. 분광광도계로 흡광도를 파장의 함수에 대응하여 측정할 수 있다. 순도는 DNA와 RNA의 흡광 스펙트럼에서 260nm에서의 흡광도가 280nm 의 약 2배이기 때문에, 그에 따라 순도를 상대적으로 추정 가능하고 260nm에서 측정된 흡광도(absorbance 260=A260)는 실제 핵산의 농도와 비례한다는 사실에 따라서 그 농도를 흡광도를 이용해 계산할 수 있다.

(1) 단가닥 dsDNA = A260 ×50 = ng/㎕

(2) 이중가닥 ssDNA = A260 ×33 = ng/㎕

(3) RNA = A260 ×40 = ng/㎕

(4) Oligonucleotide = A260 ×20~30 = ng/㎕

Use of restriction enzymes & vector in biotechnology

Vectors

biotechnology에서 vectors는 gene carrier로써  transfer된 DNA를 host cell에 넣어주기 위한 매개체 또는 DNA 조각을 의미한다.

vector로 쓰이기 위해서는 몇가지 조건이 필요하다. 첫번째로, restriction enzyme의 인식 서열이 여러개 존재하고, selectable marker가 존재하여야 한다. 그리고 벡터가 host cell에서 복제 가능해야 하며, host cell로 들어갈 수 있을 만큼 크기가 충분히 작아야 한다.

Restriction enzyme

DNA의 phosphodiester결합을 가수분해 하여 DNA를 절단시키는 효소를 nuclease라고 하고, 그 중에서 특정 DNA염기 서열만을 인식하여 가수분해 하는 효소를 restriction endonucleases라 한다. 제한 효소들은 여러 종류가 있으며, 각각 인식하는 서열이 다르기 때문에 여러 종류의 제한 효소를 이용해 다양한 종류의 DNA 조각을 얻을 수 있다.

Biotechnology is the use of living systems and organisms to develop or make useful products, or “any technological application that uses biological systems, living organisms or derivatives thereof, to make or modify products or processes for specific use” (UN Convention on Biological Diversity, Art. 2).

Biotechnology의 생물의 생체 시스템을 이용하여 products를 만들어 내고, 그 시스템을 이용하여 특정한 목적에 사용한다는 위의 정의에서 볼 때, 유전자 재조합(gene recombination)기술은 biotechnology의 핵심이다. 이러한 생명공학 기술은 3단계의 과정을 기본으로 하는데, 첫째는 준비단계, 둘째는 재조합단계, 그리고 정제단계로 이루어 진다.

준비 단계에서는 생물의 시스템을 이용하여 얻고자 하는product나 목적이 정해 졌다면, 그것을 수행할 수 있도록 도와주는 Vector나 효소, buffer, 장비들을 결정하고, 계획해야 한다. 예를 들어 특정한 단백질을 미생물이 만들도록 하는 목적을 가졌다면, 그 단백질의 유전자에 대한 정보와, 그 유전자 자체를 준비해야 한다.

그리고 그 유전자를 세포 시스템 안에서 이용되게 하기 위해서 재조합 단계를 거쳐야 한다. 그 방법은 특정 단백질을 만들어내는 유전자를 제한 효소를 이용하여 잘라내서, 벡터라 불리는 플라스미드에 끼워 넣어, 플라스미드가 원핵 생물안에 넣는 transformation이 대표적이다.

마지막으로 그 다음으로 그 생물이 우리가 원하는 단백질을 생산하는지 검출하고, 그 물질을 정제하는 단계(Downstream processing)를 거쳐 순수한 물질을 얻는다. 정제 과정에서는 특히 불순물을 제거하는 것이 매우 중요하며 이 과정에서 흔히 여러 화학적 기법이 동원된다.

Restriction enzyme의 발견과 이용기술의 발전은 위의 준비과정에서 필요한 유전 형질이나, 원하는 활성을 가지는 단백질을 유전자를 다루기 쉬운 크기로 자르게 함으로써 그 정보를 수집하는데 효과적으로 작용했다. 또한 transformation을 위한 목표 단백질이 유전자가 있는vector가 필요한데, 그 vector를 만드는 하나의 방법은 plasmid에서 특정 부분을 잘라내어 유전자를 끼워 넣는 방식으로 만들어지는데, 이때 plasmid의 특정부분을 자르는데 제한 효소가 사용된다.

Agarose gel electrophoresis

원리

DNA를 크기에 따라 분리하는 방법이며, DNA backbone group으로 인해 전기영동에 사용되는 용액 안에서 음전하를 띄고, gel에 전기를 걸어주면 DNA는 negative에서 positive로 움직이는데, gel matrix를 통과하며 DNA가 이동하므로 그 DNA가 클수록 더 느리게 이동하기 때문에 크기에 따라 DNA가 분리 된다.

전기영동시 DNA의 이동에 영향을 주는 요인

electrophoresis시, 전압이 너무 낮으면 전기영동의 시간이 오래 걸리고, 전압이 너무 높으면 gel의 저항이 높아져 gel의 온도가 올라간다. 온도가 올라가면 해상력이 낮아질 수 잇다. 최적 전류는 gel의 두께와 길이에 따라 결정되는데, gel의 두께가 두꺼울 수록 낮고 길이가 길수록 높게 잡아야 한다.

DNA 분자의 크기가 클수록 느리게 이동한다.

Agarose gel의 농도가 높을수록 느리게 이동한다.

DNA의 구조에 따라 이동속도가 다르다.

(supercoiled DNA, linear DNA, open circular DNA 순으로 빠르다.)

전기장의 방향은 이동속도에 영향을 미친다.

전기영동 완충용액의 성분과 이온강도는 이동속도에 영향을 준다.

DNA loading dye는 이동속도에 영향을 미친다.

Intercalating dye로 EtBr을 사용하는데 이 분자는 평면적 분자구조를 가지고 있으며, DNA base사이로 끼어들어 DNA이동 속도를 15%정도 늦춘다. 그러나UV-lamp아래서 형광을 내기 때문에 DNA band를 쉽게 관찰 할 수 있도록 도와준다.

Reference

DNA 정량(자외선 분광법) [internet][cited 2014.05.26] available from

http://hyunoky.blog.me/50033918647

제한효소(Restriction enzyme, restriction endonuclease) [internet][cited 2014.5.26] available from

http://blog.naver.com/smatice37?Redirect=Log&logNo=70107733262

[전기영동]아가로오스 젤 전기영동(Agarose gel electrophoresis)및 DNA의 정량 계산 [internet] [cited2014.05.26] available from

http://blog.naver.com/bsi1223?Redirect=Log&logNo=90098618701

Agarose gel electrophoresis [internet][cited 2014.05.26] available from

 

http://blog.naver.com/PostView.nhn?blogId=lby51&logNo=50142989656

Post-lab

  • Purpose

agarose gel을 만들고 agaros gel electrophoresis 하는 방법과 원리를 익힌다.

3종류의 Restriction enzyme을 가한 pGLO를 관찰하여 각 enzyme의 역할과 차이를 추측해본다.

Agarose gel electrophoresis 결과와 이론 값 (Restriction enzyme이 인지하는 부분의 갯수)과의 차이를 비교하고 분석한다.

  • Material
  • Method
  • Result
  • Discussion
  1. Result 분석

pGLO plasmid는 5371bp로 이루어 져 있으며 원형구조로 되어있다. 그리고 대부분 supercoiled 되어있어서 부피가 작아져 gel을 더 잘 통과한다. 그 결과가 lane 1의 진한 band로 나타났다. lane 1의 연하게 나온 band DNA 두가닥 중 한 가닥이 잘린 nicked form일 가능성이 있다. 완전한 linear form일 것이라 예상되는 lane2의 강한 band보다 덜 loading 이 진행된 것을 보아 linear  보다는 복잡한 모양이거나 gel을 통과하기 어려운 특징을 가졌을 것이라 추측할 수 있다. 두번째 lane의 강한 band는 EcoR1이 인지하고 끊는 부분이 한 군데라는 정보 <Figure 2>에서 linear DNA임을 알 수 있다. 5000bp보다 높은 위치에 band가 나온걸 보아 5371bp가 적절히 측정 된 것으로 보인다.

  • Reference

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